Лечение наследственных болезней человека. Генетические заболевания. Биология – наука, изучающая закономерности возникновения и развития жизни на земле

В отношении человека, как объекта генетических ис­следований существует две точки зрения:

Одни полагают, что человек является крайне небла­гоприятным объектом генетических исследований.

Другие, наоборот, находят в человеке много преимуществ.

Почему же человек – неблагоприятный объект для генетических исследований?

а) Невозможность экспериментальных браков, т.е. искус­ственного создания брака (скрещивания). Нельзя по заранее составленной схеме получить и проанализировать потомство от родителей с известным генотипом. Еще Н.К.Кольцов в 1923 году писал "... мы не можем заставить Н.Нежданову выйти замуж за Ф.Шаляпина, чтобы посмотреть, каковы у них будут дети". При генетическом анализе человека как бы выпадает основа гибридологического метода – экспериментальное скрещивание. Этот "недостаток" можно преодолеть двумя путями: 1) среди множества человеческих семей исследователь может найти такие, которые соответствуют его схемам исследования; 2) успешно разрабатываемый метод гибридизации соматических клеток позволяет уже в некоторых случаях проводить генетический анализ, используя культуру клеток человека.

б) Ограниченное количество потомков (1–2–3 ребенка) в семье. Даже в государствах с большим приростом населения количество детей в семье не более 3–4, а 10–15 детей – крайне редко. В любом случае размер семьи настолько мал, что не позволяет вести анализ расщепления признаков в потомстве в пределах одной семьи. Однако, зная признак, по которому анализируется потомство, можно подобрать не одну, а необходимое количество семей.

в) Длительность смены поколений. Для смены одного поколения человека нужно в среднем 30 лет, а это значит, что генетик не может наблюдать более 1–2 поколений. Этот недостаток в известной мере устраняется большими популяциями человека, регистрацией признаков в течение длительного времени (на протяжении нескольких поколений).

г) Достаточно большой по количеству набор хромосом (групп сцепления). Он состоит из 23 пар, что затрудняет их генетическое и цитологическое картирование и снижает тем самым возможность генетического анализа.

д) Модификация наследственной изменчивости под влиянием образа жизни, социальных факторов.

е) Организационные недостатки (но они исправимы): плохая сохранность документации, неудовлетворительная регистрация браков, рождаемости, смертности, диагностики наследственных болезней и статистики.

Преимущества человека, как генетического объекта:

а) Хорошая изученность фенотипа человека – анатомическая, физиологическая, иммунологическая, биохимическая, клиническая. Специалисты различного профиля продолжают независимо от интересов генетиков изучать человека, что несомненно помогает генетику легко распознавать многие формы наследственных отклонений.

б) Возможность использовать все методы, применяемые в медицине (биохимические, морфологические, иммунологические, электрофизиологические, клинические и др.), т.е. любые методы, которые дают возможность регистрировать признак и выражать его количественно.

Для решения сугубо генетических задач применительно к человеку в настоящее время используют следующие методы:

Генеалогический (генеалогия – греч. genealogia; от genea рождение, происхождение, поколение + logos слово, изложение – установление родственных связей между индивидумами в пределах одного поколения или в ряду поколений, или родословная) – метод родословных, т.е. прослеживание болезни (или признака) в семье или роду с указанием типа родственных связей между членами родословной. В медицинской генетике его часто называют клинико-генеалогическим, так как речь идет об изучении патологических признаков в семье с помощью клинических приемов обследования. Он относится к наиболее универсальным методам в генетике человека. Этот метод используется для установления наследственного характера признака, определения типа наследования и пенетрантности гена, при анализе сцепления генов и картирования хромосом, при изучении интенсивности мутационного процесса, при расшифровке механизмов взаимодействия генов, при медико–генетическом консуль­тировании. Суть этого метода сводится к выяснению родственных связей и к прослеживанию признака или болезни среди близких и дальних, прямых и непрямых родственников. Он включает два этапа: составление родословных и генеалогический анализ.

Составление родословной начинается с пробанда (лицо, первое попавшее в поле зрения исследователя). Чаще всего это больной или носитель изучаемого признака. Дети одной родительской пары называются сибсами (братья–сестры). Семьей в узком смысле называют родительскую пару и их детей. Обычно родословная собирается по одному или нескольким признакам. Она может быть полной (составление по восходящему, нисходящему и боковым направлениям) и ограниченной. Для наглядности готовят графическое изображение родословной. Грубой ошибкой является искусственное укорочение звеньев родословной в связи с трудностями обследованных родственников II и III степени. Генеалогический анализ позволяет установить генетические закономерности: наследственный характер признака и тип наследования.

Недостатки и ошибки при использовании генеалогического метода могут быть обусловлены неправильной диагностикой болезни (признака) и возможностью неправильного определения отцовства за счет внебрачных связей (от 1–3 до 10%).

Близнецовый метод – исследование генетических закономерностей на близнецах. Он был предложен Gallon в 1875 г. При использовании этого метода производится сопоставление монозиготных близнецов сдизиготными, партнеров монозиготных пар между собой, данных анализа близнецовой выборки с общей популяцией.

Монозиготными близнецами (однояйцевые, идентичные) называются индивиды, выросшие из одной зиготы, раз­делившейся на ранних стадиях дробления на 2 части; они обладают поэтому идентичными генотипами. Дизиготные близнецы (двуяйцевые, неидентичные) возникают за счет оплодотворения двух яйцеклеток, развивающихся в течение одной беременности. Они имеют в среднем 50% идентичных генов, но отличаются от обычных сибсов значительно большей общностью факторов среды.

Общая частота родов двойнями равна приблизительно 1%, из которых 1/4–1/3 приходится на рождение монозиготных близнецов. Близнецовый метод применяется для:

оценки соотносительной роли наследственности и среды в развитии признака;

установления наследственного характера признака и определения пенетрантности гена;

оценки действия некоторых внешних факторов: лекарственных препаратов, методов воспитания, обучения.

Этот метод включает 3 этапа: 1) сопоставление близнецовой выборки, 2) установление зиготности, 3) сопоставление пар и групп близнецов по рассматриваемым признакам.

Диагностика основывается на анализе наиболее изученных моногенных полиморфных признаков (эритро– и лейкоцитарные антигены, группы белков сыворотки крови и т.д.). Дизиготные близнецы в отличие от монозиготных отличаются по этим признакам. Если какой–либо качественный признак встречается у обоих близнецов данной пары – это конкордантная пара, а если только у одного из них – это дискордантная пара близнецов.

Популяционно-статистический метод основан на использовании наследственных признаков в больших группах населения из одной или нескольких популяций, в одном или нескольких поколениях. Изучаются выборки из конкретных популяций с применением статистической обработки полученного материала. Этот метод используется для изучения:

а) частоты генов в популяции, включая частоту нас­ледственных болезней,

б) мутационного процесса,

в) роли наследственности и среды в возникновении болезней, особенно болезней с наследственным предрасположением,

г) роли наследственности и среды в формировании фенотипического полиморфизма по нормальным признакам,

д) значения генетических факторов в антропогенезе, в частности в расообразовании.

Возможные ошибки этого метода могут быть связаны с недоучетом миграции населения и с тем, что выбранные группы отличаются по большему числу признаков, чем сравниваются.

Цитогенетический метод основан на микро­скопическом изучении хромосом. Его начали широко использовать в генетике человека только с 20–х годов XX века для:

диагностики хромосомных болезней,

составления карт хромосом,

изучения мутационного процесса,

решения некоторых эволюционных проблем в генетике человека,

изучения нормального хромосомного полиморфизма в человеческой популяции.

Именно с этим методом связано открытие всех форм хромосомных болезней. С его помощью изучается частота хромосомных и геномных мутаций в зародышевых клетках и частота хромосомных аберраций в соматических клетках. Культуры соматических клеток человека являются хорошими объектами для проверки мутагенности факторов среды (физических, химических, биологических). Цитогенетическими методами изучаются механизмы мутагенеза.

Основные сведения о морфологии хромосом человека получены при их изучении в метафазе митоза и профазе–метафазе мейоза. Для прямого хромосомного анализа можно использовать клетки костного мозга и гонад (семенников), полученные путем биопсии, что ограничивает цитогенетические исследования без культивирования. Поэтому основные цитогенетические работы выполнены на культурах клеток человека, особенно на лимфоцитах периферической крови.

Культивирование лейкоцитов периферической крови в течение 2–3 суток в присутствии ФГА позволяет получить большое число метафаз. Кроме лейкоцитов, можно культивировать клетки эпидермиса, амниотической жидкости. "Сортировка" хромосом (во время метафазы) прямо под микроскопом или чаще всего на микрофотографиях позволяет построить кариотип – т.е. упорядоченно расположить хромосомы по их отличительным признакам. В основе идентификации хромосом лежит два признака: общая длина хромосомы и расположение центромера; но он не позволяет индивидуально идентифицировать все хромосомы. Поэтому используются более точные методы: радиоавтографический, окраску хромосом флуорохромами, красителем Гимзы, гибридизации нуклеиновых кислот на цитологических препаратах.

Методы генетики соматических клеток . Поскольку соматические клетки содержат весь объем генетической информации, на них можно изучать генетические закономерности целостного организма. Соматические клетки человека характеризуются 5основными свойствами, позволяющими их использовать в генетических исследованиях:

быстрое размножение их на питательных средах, что позволяет получать необходимое их количество для анализа,

они подвергаются клонированию –можно получать генетически идентичное потомство,

разные клетки могут сливаться, образуя гибридные клоны,

легко подвергаются селекции на специальных питательных средах,

хорошо и долго сохраняются при глубоком замораживании.

Культуру соматических клеток человека получают для генетических исследований из материала биопсий или аутопсий (кожа, опухоли, периферическая кровь, костный мозг, ткань эмбрионов, клетки из околоплодной жидкости). В настоящее время чаще используются фибробласты и лимфоидные клетки. В генетике человека используют 4метода из генетики соматических клеток: простое культивирование, клонирование, гибридизация и селекция.

В настоящее время обосновано 4 подхода в борьбе с наследственными болезнями:

Массовое "просеивание" новорожденных на нас­ледственные дефекты обмена веществ.

Пренатальная диагностика.

Медико-генетическое консультирование.

Контроль за мутагенной опасностью факторов окружающей среды.

Массовое "просеивание " новорожденных на наследственные болезни обмена веществ наряду с другими методами является основой профилактики наследственных болезней в популяциях. "Просеивание" (аналог –"скрининг") означает предположительное выявление недиагностированной ранее болезни с помощью тестов, обследований или других процедур, дающих быстрый ответ.

Проще говоря, просеивание –это обследование контингентов с целью подразделения их на группы с высокой и низкой вероятностью заболевания. "Просеивают" заболевания, для которых установлена связь между мутантным геном и поврежденной биохимической функцией. Изменения в биохимических параметрах по срокам своего проявления предшествуют возникновению клинических симптомов.

Современные программы массового просеивания предусматривают выявление фенилкетонурии, гипотиреоза, врожденной гипоплазии надпочечников, галактоземию, муковисцидоз, гомоцистинурию, лейциноз, гистидинемию, аминоацидопатии, недостаточность альфа–1–антитрипсина. В практике массового просеивания на наследственные болезни обмена веществ используется кровь (пуповинная, капиллярная, венозная) и сыворотка крови.

Просеивание в зависимости от искомого дефекта проводят среди различного контингента с учетом возраста, национальной и расовой принадлежности. Просеивание на наследственные аминоацидопатии и гипотиреоз необходимо проводить в первые дни жизни, чтобы терапия оказалась эффективной; просеивание на носительство гемоглобинопатии и болезни Тея–Сакса –у вступающих в брак. Просеивание на гемоглобинопатию целесообразно в популяциях или расовых группах, подвергшихся действию малярийного фактора отбора, а просеивание на носительство болезни Тея–Сакса (в Израиле) –у евреев–ашкенази, у которых мутантный ген встречается в 10раз чаще, чем в других популяциях.

Например, в программах массового просеивания на фенилуксусную кислоту и другие аминоацидопатии используют три метода: микробиологический по Гатри (на его долю приходится 90%),хроматографический и флюорометрический.

Пренатальная диагностика осуществляется с помощью разных методов исследования в Iи IIтриместрах беременности. В ней нуждается 10–15%семей, обращающихся в медико–генетическую консультацию. Показания к проведению пренатальной диагностики:

пожилой возраст родителей,

гетерозиготное носительство хромосомной аномалии,

предыдущее рождение ребенка с болезнью Дауна, врож­денными пороками развития или умственной отсталостью,

Х–сцепленная патология,

наследственные дефекты метаболизма,

тератогенные воздействия.

Пренатальная диагностика представляет собой комплексное исследование, основанное на использовании лабораторных и инструментальных методов:

ультразвуковое исследование (врожденные пороки развития),

фетоскопия используется для взятия образцов крови, кожи или других органов плода (показания –токсоплазмоз, вирусная краснуха, гемофилия, талассемия, осложнения связанные с самопроизвольным прерыванием беременности),

фетоамниография использовалась до появления УЗИ для диагностики врожденных пороков развития костной системы, спинномозговых и пупочных грыж и особенно атрезий желудочно–кишечного тракта. Использование контрастных веществ вызывает осложнения как у беременной, так и у плода,

диагностический амниоцентез (в сроки 14–20недель беременности) –это акушерско–хирургическая процедура, позволяющая получить амниотическую жидкость для после­дующих лабораторных исследований (в 1–2%случаев после амниоцентеза наблюдается гибель плода). Амниотические клетки используют для культивирования и цитогенетических исследований, для диагностики лизосомных болезней, альфа–фетопротеина, для диагностики более 60форм наследственных ферментопатий,

диагностическая биопсия хориона (хориоцентез). Оптимальный срок для биопсии –17–я неделя беременности, а результаты, связанные с культивированием амниотических клеток, могут быть получены спустя 3–5недель. Используют 3 основных методики получения биоптата хориона: с помощью щипцов, методом эндоцервикальной аспирации и с помощью браши (по типу лабораторного ершика для пробирок). Этот метод используют для диагностики хромосомных и биохимических (молекулярных) нарушений.

Медико-генетическое консультирование включает:

выявление наследственной формы патологии на основании осмотра больного, составления родословной, цитологических, биохимических, кариологических и других методов диагностики наследственных болезней,

определение степени риска появления потомства с наследственными дефектами развития у лиц из семей, отягощенных наследственной патологией, вступающих в брак и желающих иметь детей. В обоснованных случаях рекомендуется воздержаться от заключения брака,

выявления нарушений в геноме, обменных процессов у пло­да с помощью методов пренатальной диагностики с возможным дальнейшим прерыванием беременности, если риск рождения больного ребенка достаточно высок. Однако, принятие оконча­тельного решения о прерывании или сохранении беременности остается за супругами,

искусственное осеменение от генетически здорового доно­ра применимо в тех случаях, когда рождение здорового потом­ства невозможно из-за доминантного характера наследования патологии.

Контроль за мутагенной опасностью факторов окружающей среды осуществляют генетики, экологи, врачи гигиенического профиля, учитывая естественный фон радиации и его колебания, дрейф мутаций и т.п.

Принципы лечения наследственных заболеваний:

Симптоматическое лечение –хирургическое лечение расщелины верхней губы и твердого неба, сросшихся пальцев, коррегирующие линзы при близорукости и др.

Патогенетическая терапия –воздействие на те механизмы, которые формируют наследственное заболевание:

заместительная терапия –восполнение недостающего компонента (введение инсулина при сахарном диабете, свертывающих факторов при гемофилии и т.д.) или удаление части железы при гиперфункции;

когда повышен синтез тех или иных веществ, то уменьшают их образование путем применения медикаментов, угнетающих их образование;

диетотерапия –при нарушении расщепления тех или иных веществ (галактозы, фенилаланина) их исключают из диеты;

медикаментозное лечение направлено на удаление про­дуктов, избыточно накапливающихся в организме. Например, при поражении печени в ней накапливаются ионы меди, поэтому применяют ионообменные смолы, которые препятствуют вса­сыванию меди в кишечнике.

Генная инженерия –это направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которого является получение с помощью лабораторных методов организмов с новыми комбинациями наследственных свойств. В основе лежит целенаправленное манипулирование с фрагментами нуклеиновых кислот, т.е. конструируются из различных фрагментов генетического материала нужные фрагменты и вводятся в реципиентный организм.

Современные методы диагностики позволяют выявлять наследственные болезни на самых ранних стадиях, что является условием их успешного лечения и коррекции, как медикаментозной, так и хирургической. При лечении наследственных болезней, как и любых других, используются три подхода, определяющих три уровня вмешательства (коррекции) в развитие патологического процесса: симптоматический, патогенетический и этиологический.

1. Симптоматическое лечение направлено на облегчение, коррекцию и ликвидацию конкретных симптомов болезни посредством медикаментозной терапии, хирургического лечения, физиотерапевтических, рентгенорадиологических и других методов. Это может осуществляться с помощью обезболивающих препаратов, транквилизаторов, стимуляторов, противосудорожных средств, которые показаны всегда при наличии соответствующих симптомов независимо от порождающей эти симптомы причины.

Хирургические методы нашли широкое применение в лечении врожденных пороков развития, например, при врожденных расщелинах губы и нёба, полидактилии, синдактилии, врожденных сужениях привратника и вывихе бедра, коррекции пороков сердца и других внутренних органов. Хирургическое лечение применяется при меконеальном илеусе (непроходимости кишечника), пневмотораксе и муковисцидозе. Реконструктивная хирургия, кроме того, играет значительную роль при коррекции костно-мышечной системы и гипоспадии.

2. Патогенетическое лечение ближе к этиологическому, однако, в отличие от последнего не устраняет причину болезни. С помощью подобного лечения происходит разрыв цепи патологических процессов, что предотвращает формирование патологического фенотипа. Суть лечения состоит в выведении каких либо продуктов из организма, если ген продуцирует их в избытке, либо в добавлении, замещении недостающих продуктов, если ген не работает. Принцип заместительной терапии наследственных нарушений обмена заключается во введении в организм отсутствующих или недостающих биохимических субстратов.

Ограничение определенных веществ в пище, или диетотерапия, является для многих наследственных нарушений обмена единственным патогенетическим методом лечения и профилактики.

Диетическое ограничение применяется при лечении многих наследственных болезней обмена аминокислот и углеводов - фенилкетонурии, гистидинемии, цистинурии, тирозинемии, целиакии, галактоземии, фруктоземии, непереносимости лактозы и др. Обычно заболевание проявляется либо в первые часы (муковисцидоз, галактоземия) или в первые недели (фенилкетонурия, гаммаглобулинемия и т.д.) жизни ребенка, приводя к умственной отсталости и даже к летальному исходу. Эффективность метода зависит от раннего и точного диагноза, соблюдения гомеостатического принципа лечения, под которым понимается максимальная адаптация диеты к требованиям растущего организма, тщательный клинический и биохимический контроль за проведением диетотерапии. При фенилкетонурии отмечается недостаточность фермента фенилаланин-4-гидроксилазы, превращающего аминокислоту фенилаланин в тирозин. В результате фенилаланин превращается не в тирозин, а в продукты нарушенного обмена - фенилпировиноградную кислоту, фенилэтиламин и т.д., которые, взаимодействуя с клеточными мембранами нейронов в ЦНС, препятствуют проникновению в них триптофана, без которого невозможен синтез многих белков и развиваются необратимые процессы в головном мозге. Заболевание начинает развиваться, как только в организм ребенка с молоком матери начинает поступать фенилаланин. Такой ребенок переводится на искусственное вскармливание специальными белками - гидролизатами. Однако фенилаланин относится к числу незаменимых, т.е. не синтезируемых в организме человека, аминокислот и должен поступать в организм в минимально необходимых количествах. Современные пищевые рационы для детей с фенилкетонурией составляются в точном соответствии с его концентрацией в крови по данным биохимического анализа.

Начало диетотерапии в первые 2-3 месяца жизни обеспечивает нормальное развитие ребенка. Если лечение начать в сроки от трех месяцев до года, то эффективность лечения снижается до 26% , а эффективность лечения, предпринятого в возрасте от одного года до трех лет, составляют менее 15 % . Настораживающими в отношении фенилкетонурии признаками являются плохая прибавка в массе, рвота, отклонения со стороны центральной нервной системы, отягощенный анамнез.

Усиленное выведение продуктов нарушенного обмена. Лечение проводится с помощью некоторых веществ в частности D-пеницилламин, который связывает и ускоряет выведение накопленных в клетке ионов меди (при болезни Вильсона Коновалова). При гемоглобинопатиях необходимо усиленное выведение железа, что осуществляется с помощью десферала. Такое выведение возможно не только посредством определенных химических веществ, но и с помощью таких физико-химических методов, как плазмаферез и гемосорбция. Плазмаферез применяется для освобождения крови от излишка жирных кислот, фитановой кислоты при синдроме Рефсума. Этот метод эффективен также в отношении болезней Фабри и Гоше (лизосомных болезней накопления). Гемосорбция используется для выведения низкой плотности при лечении семейной гиперхолестеринемии.

Метаболическая ингибиция и индукция метаболизма. Ряд лекарственных препаратов (фенобарбитал, левомицетин), а также половые гормоны (эстрогены) являются индукторами метаболизма, а их введение в организм связано с усилением синтеза некоторых ферментов и ускорением процессов, в которых эти ферменты принимают участие. Так, индукцию синтеза фермента глюкуронилтрансферазы можно вызвать введением фенобарбитала больным с синдромом Криглера - Найяра, у которых нарушено образование глюкоронидов билирубина в связи с недостаточностью этого фермента.

Индукцию церулоплазмина, участвующего в метаболизме меди, вызывает введение в организм эстрогенов при болезни Вильсона- Коновалова. Метаболическая ингибиция используется в тех случаях, когда нужно затормозить синтез накапливаемого при наследственной болезни субстрата или его предшественника.

Например, используют аллопуринол, который ингибирует ксантиноксидазу, благодаря чему уменьшается концентрация мочевой кислоты в крови при синдроме Леша - Нихана и подагре. Коррекция обмена на уровне продуктов гена. Примерами возмещения продукта, не вырабатывающегося организмом в связи с дефектом фермента, могут служить введение стероидных гормонов при врожденной гиперплазии надпочечников, тироксина при гипофункции щитовидной железы, гормона роста при гипофизарной карликовости, введение внутриклеточных белков при лечении лизосомных болезней.

Применение инсулина при сахарном диабете позволило резко снизить смертность и инвалидизацию больных. Лечение препаратами йода и тиреоидными гормонами эффективно при наследственных дефектах синтеза тиреоидных гормонов, глюкокортикоидами при нарушениях стероидного обмена. Одно из проявлений, наследственно обусловленных врожденных иммунодефицитных состояний - дисгаммаглобулинемия эффективно лечится введением гамма - глобулина и полиглобулина. Заместительная терапия проводится при ряде наследственных дефектов обмена, патогенез которых связан с накоплением продуктов метаболизма.

3. Этиологическое лечение является наиболее кардинальным и заключается в устранении причины наследственной болезни, т.е. в изменении структуры ДНК во многих клетках. Этой задаче способствует завершение расшифровки генома человека. Именно это направление получило название генной терапии. Для введения ДНК в клетки больного используют различные подходы: химические, физические, биологические, наиболее часто - вирусные. Последние используются не только для лечения наследственных болезней, но и для лечения злокачественных опухолей или хронических вирусных инфекций

Суть метода во введении в клетки-мишени вируса со встроенной в него клонированной ДНК или с ДНК(рекомбинантный вектор). Например, введение в скелетную или сердечную мышцу с ДНК отсутствующего в них белка дистрофина является эффективным при лечении миодистрофий Дюшенна и Беккера. Лечение может контролироваться также при помощи высокоспецифичных моноклональных антител, направленных на конкретный экзон мутантного гена дистрофина.

Наконец, имплантация миобластов - нормальных клеток - предшественников мышечной ткани от отцов больным мальчикам приводит к конвергенции не содержащих дистрофина мышечных волокон в дистрофинсодержащие, что нормализует состояние мышечной ткани.

Аллотрансплантация может рассматриваться как передача нормальной генетической информации больному с наследственным нарушением обмена веществ. Производится пересадка клеток, тканей и органов, содержащих нормальную ДНК, продуцирующую нормальный продукт гена у реципиента.

При мукополисахаридозах производят подкожную подсадку культивированных фибробластов от здорового донора. Эти клетки секретируют нормальные ферменты и исправляют нарушенный обмен мукополисахаридов.

ОБЩИЕ ВОПРОСЫ

Эмпирические попытки лечить больных с наследственной патологией, предпринимавшиеся в течение 200 лет вплоть до 30-х годов XX в., не дали положительных результатов. Диагноз наследственной болезни оставался приговором больному и его семье: такие семьи считали вырождающимися. Эта позиция в медицине в первые десятилетия XX в. опиралась, по-видимому, также на генетическую концепцию об очень строгой детерминации менделирующих наследственных признаков. В связи с этим в начале XX в. возникла негативная евгеника, призывавшая насильственно ограничить деторождение у лиц с наследственной патологией. К счастью, практическая реализация негативной евгеники была недолгой из-за общественного давления.

Переломным периодом в отношении лечения наследственных болезней можно считать 20-30 годы, так, в середине 20-х годов в экспериментах на дрозофиле были получены факты, показывающие разную степень проявления действия генов в зависимости от влияния генотипической или внешней среды. На основе этих фактов были сформированы понятия о пенетрантности, экспрессивности и специфичности действия генов. Стала возможной логическая экстраполяция: если среда влияет на экспрессивность генов, то, следовательно, можно уменьшить или исключить патологическое действие генов при наследственных болезнях. На основе этих положений выдающийся русский биолог Н.К. Кольцов предложил и обосновал новое направление в медицинской генетике - евфенику - учение о хорошем проявлении наследственных задатков. По его мнению, евфеника должна изучать все условия среды, стимулирующие проявления положительных и непроявления отрицательных (наследственные болезни) наследственных свойств.

* Исправлено и дополнено при участии д-ра мед. наук, проф. А.Ю. Асанова.

Впервые в мире невропатолог и генетик С.Н. Давиденков, основываясь на собственном клиническом опыте и достижениях экспериментальной генетики, в начале 1930-х годов указал на ошибочность мнения о неизлечимости наследственных болезней и вырождении семей с такими болезнями. Он, как и Н.К. Кольцов, исходил из признания роли факторов внешней и внутренней среды в проявлении наследственных болезней. С.Н. Давиденков настаивал на принципиальных возможностях вмешательства в функционирование патологических аллелей и сам много сделал для разработки методов лечения наследственных болезней нервной системы. Такая исходная позиция позволяла разрабатывать различные подходы и методы лечения лиц с наследственными болезнями на основе достижений генетики, теоретической и клинической медицины. Однако отсутствие сведений о патогенетических механизмах наследственных болезней в тот период ограничивало возможности разработки методов. Все подобные попытки, несмотря на правильные теоретические установки, оставались эмпирическими.

Лечение различных наследственных болезней может включать как традиционные в медицине подходы (лекарственные препараты, специфические диеты, хирургическую коррекцию и др.), так и воздействия на наследственные структуры, «повинные» в развитии болезни. Уровни, на которые направлено терапевтическое воздействие, во многом определяются состоянием знаний о первичном генетическом дефекте, его клинических проявлениях, взаимодействии с факторами среды и пониманием путей, на которых возможно исправление дефекта. Обобщенная схема точек приложения лечебных воздействий приведена на рис. 10.1.

В настоящее время благодаря успехам генетики в целом и существенному прогрессу теоретической и клинической медицины можно

Рис. 10.1. Принципиальная схема «мишеней» для лечения наследственных болезней

утверждать, что уже многие наследственные болезни успешно лечатся. Такая установка должна быть у врача.

Общие подходы к лечению наследственных болезней сходны с подходами к лечению болезней любой другой этиологии. При наследственных болезнях полностью сохраняется принцип индивидуализированного лечения, ведь врач и при наследственной патологии лечит не просто болезнь, а болезнь конкретного человека. Возможно, что при наследственной патологии принцип индивидуализированного лечения должен соблюдаться еще строже, потому что гетерогенность наследственных болезней далеко не расшифрована, а, следовательно, одну и ту же клиническую картину могут вызвать разные наследственные болезни с различным патогенезом. В зависимости от условий пре- и постнатального онтогенеза, а также от всего генотипа человека фенотипические проявления мутаций у конкретного человека могут модифицироваться в ту или другую сторону. Следовательно, необходима разная коррекция наследственной болезни у разных пациентов.

Как и при лечении других хорошо изученных болезней (например, инфекционных), можно выделить 3 подхода к лечению наследственных болезней и болезней с наследственной предрасположенностью: симптоматический, патогенетический, этиотропный. Применительно к наследственным болезням в отдельную группу можно выделить хирургические методы, поскольку иногда они выполняют функции симптоматической терапии, иногда - патогенетической, иногда - и той, и другой.

При симптоматическом и патогенетическом подходах используют все виды современного лечения (лекарственное, диетическое, рентгенорадиологическое, физиотерапевтическое, климатическое и т.д.). Генетический диагноз, клинические данные о состоянии больного и вся динамика болезни определяют поведение врача на протяжении всего периода лечения с постоянным и строгим соблюдением гиппократовского принципа «не навреди». При лечении наследственных болезней надо быть особенно внимательным в соблюдении этических и деонтологических норм: часто такие больные имеют тяжелую хроническую патологию с детского возраста.

СИМПТОМАТИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ

Хотя неспецифическое лечение не является главным, оно фактически используется всегда, в том числе при лечении пациентов с наследственными болезнями. Симптоматическое лечение применяют

при всех наследственных болезнях, даже если врач располагает методами патогенетической терапии. Для многих форм наследственной патологии симптоматическое лечение остается единственным.

Лекарственная симптоматическая терапия разнообразна и зависит от формы наследственных болезней. Один из древних примеров симптоматической терапии, сохранившейся до наших дней, - применение колхицина при острых приступах подагрического артрита. Такое лечение использовали еще греки в античном периоде. Другими примерами симптоматического лечения могут быть применение анальгетиков при наследственных формах мигрени, специфических транквилизаторов при психических проявлениях наследственных болезней, противосудорожных препаратов при судорожных симптомах и т.д. Успехи этого раздела терапии связаны с прогрессом фармакологии, обеспечивающим все более широкий выбор лекарств. Вместе с тем расшифровка патогенеза каждой болезни позволяет понять причину возникновения симптома, а на этой основе становится возможной более тонкая лекарственная коррекция симптомов, если первичная патогенетическая терапия еще невозможна.

В качестве примера можно привести общую схему многокомпонентного симптоматического лечения муковисцидоза. Первичное звено патогенеза (нарушение транспорта ионов натрия и хлора) скорригировать при этом заболевании еще не удается.

В связи с тем, что у больных выделяется много хлорида натрия с потом, детям с муковисцидозом в жарком сухом климате рекомендуется дополнительно добавлять поваренную соль в пищу. В противном случае иногда может наступить коллапс с тепловым ударом.

Недостаточность функции поджелудочной железы у больных (рано или поздно это наступает) восполняется препаратами сухих экстрактов поджелудочной железы животных или ферментов в капсулах (панкреатин, панзинорм  , фестал  ) и желчегонных средств. При клинических признаках нарушения функции печени проводится курс соответствующей терапии (эссенциале  , метионин, холин и др.).

Наиболее серьезными и трудными для лечения являются нарушения дыхательных путей. Закупорка просветов малых бронхов густой слизью обусловливает развитие инфекции в легочной ткани. На закупорку бронхов и инфекцию направлена симптоматическая (почти патогенетическая) терапия. Для уменьшения обструкции применяют бронхоспазмолитические

и отхаркивающие смеси (изопреналин, эуфиллин  , атропин, эфедрин и др.), препараты муколитического действия, в основном тиолы. Способ введения препарата (в ингаляциях, внутрь, внутримышечно) зависит от выраженности клинической картины. Применяют лекарства, уменьшающие внутриклеточную продукцию слизи, например мукодин  (карбоцистеин). - Лечение воспалительных осложнений в легких при муковисцидозе представляет трудную задачу, поскольку эти осложнения обусловлены несколькими видами бактерий, а иногда и грибов. С этой целью проводят интенсивную микробиологически контролируемую антибиотикотерапию (цефалоспорины третьего поколения и др.), а также лечение фторхинолонами для борьбы с синегнойной инфекцией. Антибиотики выбирают в зависимости от чувствительности микрофлоры. Наибольший эффект дает введение антибиотиков в ингаляциях и парентерально. Как видно на примере лекарственного лечения муковисцидоза, многосимптомные болезни требуют применения нескольких фармакокинетически совместимых лекарств.

Симптоматическое лечение бывает не только лекарственным. Многие виды физических методов лечения (климатотерапия, бальнеолечение, разные виды электротерапии, теплолечение) применяются при наследственных болезнях нервной системы, наследственных болезнях обмена веществ, заболеваниях скелета. После таких курсов лечения больные чувствуют себя намного лучше, продолжительность их жизни увеличивается.

Практически нет таких наследственных болезней, при которых не было бы показано физиотерапевтическое лечение. Например, лекарственное лечение муковисцидоза постоянно подкрепляется многообразными физиотерапевтическими процедурами (ингаляции, массаж и др.).

К симптоматическому можно отнести рентгенорадиологическое лечение при наследственно обусловленных опухолях до и после хирургического вмешательства.

Возможности симптоматического лечения при многих болезнях еще далеко не исчерпаны, особенно это касается лекарственной и диетической терапии.

Следует подчеркнуть, что симптоматическое лечение будет использоваться в большом объеме и в будущем наряду с самым совершенным патогенетическим или даже этиотропным лечением наследственных болезней.

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ

Лечение любых болезней путем вмешательства в патогенез всегда эффективнее, чем симптоматическое лечение. При наследственных болезнях патогенетические методы также наиболее обоснованы, хотя и не противопоставляются симптоматическому лечению. По мере изучения патогенеза каждой болезни появляются различные возможности вмешательства в этот процесс, в течение болезни или в выздоровление. Клиническая медицина развивалась на основе теоретических представлений о патологических процессах. Таким же путем идет клиническая генетика в разработке методов лечения.

Для патогенетического лечения наследственных болезней в последние годы применяют принципиально новые подходы, основанные на достижениях молекулярной и биохимической генетики. При описании генных болезней (см. гл. 4) приводились примеры расшифрованных нарушенных звеньев обмена, всех биохимических механизмов, по которым развивается наследственно обусловленный патологический процесс, - от аномального генного продукта до клинической картины болезни. Естественно, что на этой основе можно целенаправленно вмешиваться в патогенез болезни, а такое лечение фактически равнозначно этиотропному. Хотя первопричина (т.е. мутантный ген) и не устраняется, но цепь патологического процесса прерывается, и патологический фенотип (болезнь) не развивается (т.е. происходит нормокопирование).

Патогенетическое лечение должно расширяться по мере прогресса генетики развития. Пока ее вклад в разработку методов лечения наследственной патологии незначителен, хотя успехи последних лет не вызывают сомнений. В настоящее время лечение основано на коррекции отдельных нарушенных звеньев, но более эффективно было бы вмешиваться в патологический процесс на уровне системных реакций.

При патогенетических подходах к лечению наследственных болезней исходят из того, что у больных либо образуется аномальный белок (фермент), либо нормального белка вырабатывается недостаточно (до полного отсутствия). За этими событиями следуют изменения цепи превращения субстрата или его продукта. Знание этих принципов и конкретных путей реализации действия гена помогает правильно разрабатывать схемы лечения и даже терапевтическую стратегию. Это особенно четко можно проследить на примере наследственных болезней обмена веществ.

Рис. 10.2. Возможные подходы к патогенетическому лечению наследственных болезней

В обобщенном (может быть, немного упрощенном) виде возможные подходы к лечению наследственных болезней обмена веществ представлены на рис. 10.2. Видно, что для различных болезней могут быть использованы разные пути коррекции. Для одной и той же болезни можно использовать вмешательства в разных звеньях и на различных этапах развития патологического процесса.

В целом патогенетические подходы к лечению наследственных болезней в зависимости от уровня биохимического дефекта можно представить следующим образом. Лечение схематично сводится к возмещению или выведению чего-либо. Если ген не работает, то необходимо возместить его продукт; если ген производит не то, что

нужно, и образуются токсичные продукты, то необходимо удаление таких продуктов и возмещение основной функции; если ген производит слишком много продукта, то его избыток удаляют.

Коррекция обмена на уровне субстрата

Такое вмешательство - одна из наиболее частых форм лечения наследственных болезней. Коррекцию можно обеспечить разными путями, примеры которых приведены ниже. Субстратом в данном случае называется тот компонент пищи, который подвергается метаболизму с помощью генетически детерминируемого фермента (например, фенилаланин, галактоза), а при наследственной болезни он является участником патологической реакции.

Ограничение определенных веществ в пище (диетическое ограничение) было первой успешной мерой в лечении наследственных болезней обмена, при которых отсутствуют соответствующие ферменты для нормального превращения субстратов в продуктах питания. Накопление некоторых токсичных соединений или продуктов их обмена приводит к постепенному развитию болезни. При фенилкетонурии назначают диету с низким содержанием фенилаланина. Несмотря на отсутствие фенилаланингидроксилазы печени, тем самым прерывается патогенетическое звено развития болезни. Ребенок, находившийся несколько лет на искусственной диете, уже не будет страдать тяжелой формой болезни. Спустя несколько лет, чувствительность нервной системы к фенилаланину и продуктам его превращения резко снижается, и диетическое ограничение может быть уменьшено. Ограничение диеты не обязательно означает составление специального пищевого рациона. Например, новый метод ограничения поступления фенилаланина с пищей при фенилкетонурии основан на приеме внутрь желатиновых капсул, содержащих растительный фермент, который освобождает пищевые продукты от фенилаланина. При таком лечении концентрация фенилаланина в крови уменьшается на 25%. Этот метод особенно целесообразно применять у более взрослых пациентов с фенилкетонурией и беременных, не нуждающихся в строгом соблюдении диеты.

Диетическое ограничение применяется при лечении многих наследственных болезней обмена углеводов и аминокислот (галактоземии, наследственной непереносимости фруктозы и лактозы, аргининемии, цитруллинемии, цистинурии, гистидинемии, метилмалоновой ацидемии, тирозинемии, пропионовой ацидемии) и других

болезней с известным первичным дефектом. Применяются диеты, специфичные для каждого заболевания.

Ограничением определенных веществ в диете можно также лечить болезни, для которых еще не расшифрован дефект первичного продукта гена. Эмпирически установлено, например, что при целиакии (см. гл. 7) постоянные диспепсические явления провоцирует глютен. Для лечения этой болезни достаточно исключить из пищи продукты, содержащие клейковину.

Хотя селективное ограничение определенных веществ в пище широко используется для повышения эффективности лечения некоторых наследственных болезней обмена веществ, остается еще много нерешенных вопросов. Например, несмотря на 35-летний опыт лечения фенилкетонурии, еще не полностью определены оптимальные границы диеты, продолжительность курса лечения для детей, необходимость ограничения при менее тяжелых формах ферментативной недостаточности, принципы индивидуализации диеты. Диетическое ограничение должно проводиться под строгим биохимическим контролем обмена веществ.

Диетическое добавление применяется реже, чем ограничение, но этот прием также эффективен при патогенетическом лечении и вошел в практику лечения двух болезней обмена.

При синдроме Хартнапа в результате дефекта транспортной функции клеток слизистой оболочки кишечника возникает мальабсорбция триптофана. Биохимическим следствием этого становится отсутствие триптофана в крови, гипераминоацидоз, эндогенный дефицит никотиновой кислоты. У пациентов наблюдаются дерматологические, неврологические и психические проявления пеллагры. Симптомы болезни уменьшаются или даже исчезают при введении в рацион ребенка продуктов с высоким содержанием белка (4 г/кг в сутки) и добавлении никотинамида или никотиновой кислоты (по 40-200 мг 4 раза в сутки).

Особенно убедительный аргумент в пользу лечения наследственных болезней с помощью диетического добавления дает лечение гликогеноза III типа (амило-1,6-глюкозидазная недостаточность). Это заболевание сопровождается гепатоспленомегалией, гипогликемией натощак, прогрессирующей миопатией, мышечной атрофией, кардиомиопатией в результате нарушения аланиноглюкозного цикла (низкая концентрация аланина). Это приводит к распаду аминокислот в мышцах при глюконеогенезе. У большинства больных детей наступает улучшение, если белки обеспечивают 20-25% энергетической ценности пищи, а углеводы - не более 40-50%.

Усиленное выведение субстрата патологической реакции может осуществляться разными методами, которые снижают концентрацию токсичного субстрата. Полного освобождения от патологических продуктов обмена добиться трудно. Примером усиленного выведения субстрата является влияние хелатов при гепатолентикулярной дегенерации. Например, пеницилламин связывает, мобилизует и ускоряет выведение внутриклеточно накопленных ионов меди.

При гемоглобинопатиях необходимо усиленное выведение железа, чтобы не развивался гемосидероз паренхиматозных органов.

Применяемый для этих целей дефероксамин (десферал *) накапливает ферритины и освобождает организм от излишнего железа.

Можно эффективно применять и непрямые метаболические пути для выведения субстрата. Например, нормальный уровень мочевой кислоты в крови можно обеспечить выведением остаточного азота в форме не только мочевины, но и ее метаболитов. Такой прием применяется для лечения наследственных болезней, обусловленных многими энзимопатиями цикла мочевины. Подобные примеры известны и для других форм наследственных болезней обмена веществ.

Выше были приведены примеры усиленной элиминации субстратов с помощью лекарств. Этих же целей можно добиться с помощью физико-химических методов освобождения от накопленного в крови субстрата (плазмафереза и гемосорбции).

С помощью плазмафереза удаляется большой объем плазмы, содержащей токсичное вещество. Плазмаферез можно применять для освобождения крови от излишка липидов, жирных кислот, фитановой кислоты. Этот метод эффективно используется при лечении болезни Рефсума. Сделаны первые успешные попытки лечения плазмаферезом двух лизосомных болезней накопления - болезни Фабри и болезни Гоше.

Гемосорбция помогает селективно удалять вещества или классы веществ путем их связывания с родственными лигандами. Этот метод уже применяется для лечения семейной гиперхолестеринемии. В качестве лиганда для экстракорпорального связывания ЛПНП используют гепарин-агарозу, что, к сожалению, дает кратковременный эффект. Уровень холестерина возвращается к исходному через 3-7 сут после лечения.

Альтернативные пути обмена при лечении наследственных болезней приведены в табл. 10.1.

Таблица 10.1. Альтернативные пути обмена при лечении наследственных болезней

Указанный способ лечения во многом сходен с методами усиленного выведения субстрата. Разница заключается только в способах достижения цели: в одном случае усиленно выводится непосредственно субстрат, а в другом - субстрат сначала превращается в какое-то соединение, а затем это соединение удаляется.

Метаболическая ингибиция используется тогда, когда надо затормозить синтез накапливаемого при наследственной болезни субстрата или его предшественника. В качестве ингибиторов применяют разные физиологически активные соединения. Например, при синдроме Леша-Найхана и подагре используют аллопуринол, который ингибирует ксантиноксидазу, благодаря чему уменьшается концентрация мочевой кислоты в крови. Ципрофибрат ингибирует синтез

глицеридов и поэтому эффективно снижает концентрацию липидов у пациентов с гиперхолестеринемией (тип III). Стрихнин конкурирует в связывании глицина с рецепторами в ЦНС, что улучшает дыхательную и моторную функции, угнетение которых вызвано высоким содержанием глицина в спинномозговой жидкости при тяжелой некетоновой гиперглицинемии.

Коррекция обмена на уровне продукта гена

Этот подход применяется уже давно, поскольку во многих случаях в клинической медицине для некоторых болезней была установлена патогенетически ключевая роль отсутствия некоторых веществ (инсулина, гормонов роста, антигемофильного глобулина и др.).

Возмещение продукта (или добавление) с целью коррекции обмена применяется при таких нарушениях, патогенез которых обусловлен аномальным ферментом, не обеспечивающим выработку продукта, или другим биологически активным соединением.

Примеров эффективных подходов к «исправлению» наследственных нарушений обмена путем возмещения продукта уже много: введение необходимых стероидов при врожденной гиперплазии надпочечников, тироксина при гипотиреоидизме, гормона роста при гипофизарной карликовости, уридина при оротовой ацидурии. К сожалению, пока еще нет примеров возмещения внутриклеточных белков, хотя попытки в этом направлении предпринимались (например, при лечении лизосомных болезней).

Подобные примеры известны не только для нарушений обмена, но и для других наследственных болезней. Так, введение антигемофильного глобулина предупреждает кровоточивость при гемофилии, γ-глобулин помогает при агаммаглобулинемии, инсулин - при диабете.

При энтеропатическом акродерматите развивается недостаточность цинка из-за дефекта цинксвязывающего фактора в кишечнике. В этом случае состояние больных одинаково улучшают и введение грудного молока, содержащего цинксвязывающий фактор, и прием препаратов цинка внутрь. Как только концентрация цинка в крови достигает нормального уровня, состояние больных сразу улучшается.

Для лечения по принципу возмещения продукта надо знать тонкие механизмы патогенеза и вмешиваться в эти механизмы (возмещать продукт) осторожно и внимательно. Так, предварительные попытки лечения болезни Менкеса путем возмещения меди не при-

вели к успеху, хотя концентрация меди и церулоплазмина в крови больных достигала нормального уровня. Оказалось, что дефект при данной болезни обусловлен нарушением регуляции синтеза медьсвязывающего белка, обеспечивающего внутриклеточное содержание меди. По этой причине препараты меди не улучшали состояние больных.

Необходимость знания тонких механизмов обмена для лечения можно показать на примере сцепленной с Х-хромосомой гипофосфатемии. При этом заболевании первичный почечный дефект всасывания фосфата ведет к нарушению (снижению) минерализации костей (рахит) и гипокальциемии. Прием внутрь фосфата и 1,25- дигидроксихолекальциферола улучшает минерализацию костей и уменьшает гипокальциемию, но не изменяет первичного дефекта потери фосфата с мочой. В связи с этим имеется большая опасность возникновения гиперкальциемии, а значит, в процессе лечения надо контролировать содержание кальция в крови.

В целом можно ожидать дальнейших сдвигов в патогенетическом лечении путем возмещения продуктов (белков, гормонов) в связи с успехами физико-химической биологии, генной инженерии и биотехнологии. Генно-инженерными методами уже получают специфические белки и гормоны человека, необходимые для восполнения нарушенного звена обмена при лечении наследственных болезней (инсулин, соматотропин, ИФН и др.).

Хорошо известны успехи в получении и разведении трансгенных лабораторных животных. Хотя технически создание трансгенных сельскохозяйственных животных намного труднее, чем лабораторных, это решаемая задача. От крупных животных можно получить большое количество белка. Трансгенных животных, чьи клетки производят нужные белки, можно называть биореакторами. От них можно получать потомство, т.е. возможно воспроизводство из поколения в поколение.

Создание трансгенных животных начинается со сшивки двух генов, каждый из которых клонирован отдельно. Один ген кодирует нужный белок, другой взят из железы или другого органа, который будет производить этот белок. Например, если белок продуцируется с молоком, то специфическими органными генами будут гены из молочной железы.

Гибридная ДНК инъецируется в оплодотворенную яйцеклетку или в эмбрион. Примерно в 1-5% случаев ДНК встраивается

Рис. 10.3. Трансгенная свинья, которая продуцирует гемоглобин человека

Рис. 10.4. Трансгенный бык с геном человеческого лактоферрина. От него получены телята с таким же геном

в геном. Все яйцеклетки подсаживают в матку самок, а родившихся животных проверяют на присутствие гибридного гена. От животного-основателя получают потомство и таким образом создают стадо.

Один из примеров живых биореакторов - свинья, продуцирующая человеческий гемоглобин (рис. 10.3). Она «сконструирована» в 1991 г. Около 15% эритроцитов свиньи содержат человеческий гемоглобин. Его

можно отделить от свиного гемоглобина с помощью препаративных методов. Такой гемоглобин не содержит вирусы человека, хотя в отдельных случаях не исключаются аллергические реакции.

Другим трансгенным животным стала корова, которая производит человеческий лактоферрин, выделяемый с молоком. В результате подсадки трансгенной яйцеклетки родился бык (рис. 10.4), ставший отцом многих трансгенных телок, в последующем производящих лактоферрин с молоком.

Рис. 10.5. Трансгенная коза, в молоке которой содержится плазминогенный активатор (тромболитический фермент)

Получены и другие трансгенные животные. Трансгенная коза (рис. 10.5) выделяет с молоком активатор плазминогена, который растворяет тромбы, трансгенные кролики - фермент α-глюкозидазу для лечения болезни Помпе, трансгенные куры несут яйца с человеческими антителами.

В последние годы отечественные ученые разработали менее долгий и недорогой способ трансгеноза органов-мишеней. Необходимый ген вводят не в яйцеклетку, а непосредственно в молочную железу. Трансген у таких животных присутствует только в вымени. Получены соматические трансгенные коровы, свиньи и козы, служащие биореакторами для фармацевтической промышленности.

Коррекция обмена на уровне ферментов

Многоступенчатый путь превращения субстрата в процессе обмена осуществляется с помощью соответствующих ферментов. Большая группа наследственных болезней обусловлена мутациями в генах, детерминирующих синтез ферментов (энзимопатии). Вмешательство в развитие болезни (коррекция) на уровне фермента является примером патогенетического лечения первичных этапов, т.е. приближающегося к этиотропному лечению. Этот вид лечения применяется для коррекции наследственных болезней обмена веществ, при которых известен функционально аномальный фермент. Для такого лечения можно вводить кофактор или индуцировать (угнетать) синтез фермента с помощью лекарств либо возмещать недостаток фермента.

Введение кофактора используется при многих наследственных болезнях. Как известно, некоторые врожденные аномалии обмена связаны с нарушением синтеза или транспортировки специфических кофакторов, что изменяет нормальную каталитическую активность фермента. В этих случаях добавление соответствующего кофактора повышает активность фермента и в значительной мере исправляет метаболический дефект. Показано, что при витаминозависимых состояниях повышение остаточной активности мутантных ферментных комплексов обеспечивает не только биохимическое, но и клиническое улучшение состояния. Известны многочисленные примеры лечения наследственных болезней путем добавления кофакторов, далеко не исчерпывающая классификация которых представлена в табл. 10.2.

Таблица 10.2. Нарушения обмена, при лечении которых добавляют кофактор

Из таблицы 10.2 видно, что при лечении наследственных болезней один и тот же кофактор может выполнять разные функции. По-видимому, будет перспективным введение кофактора для внутриутробного лечения плода (как в случае β-зависимой метилмалоновой ацидемии).

Модификация ферментативной активности

Это уже сложившийся подход при лечении наследственных болезней обмена. Стратегия такого лечения отражена в табл. 10.3, в которой приведены отдельные примеры.

Таблица 10.3. Лечение наследственных болезней путем модификации ферментативной активности

Окончание таблицы 10.3

Индукцию синтеза фермента можно использовать для повышения остаточной ферментативной активности путем введения лекарств. Например, фенобарбитал и родственные ему препараты стимулируют функцию эндоплазматического ретикулума и синтез специфичных для него ферментов. В связи с этим фенобарбитал применяют для лечения синдромов Жильбера и Криглера-Найяра. При этом снижается уровень билирубина в плазме крови. Такой подход имеет определенное значение при болезнях, обусловленных недостаточной продукцией ферментов, вырабатываемых в эндоплазматическом ретикулуме.

Индукция синтеза ферментов с помощью даназола (дериват этинилтестостерона) применена для лечения недостаточности α 1 -антитрипсина и ангионевротического отека. При недостаточности α 1 -антитрипсина применение даназола в течение 30 дней существенно повышает уровень этого белка в сыворотке. Таким образом, данный метод можно использовать для предупреждения легочных осложнений.

Ангионевротический отек сопровождается снижением количества функционально активного сывороточного ингибитора эстеразы С на 50%. Применение андрогенов повышает в 3-5 раз уровень ингибитора эстеразы. Профилактический прием внутрь даназола снижает или предупреждает острый ангионевротический отек, оказывает минимальную вирилизацию и связан с наименьшей токсичностью для печени.

Подавление синтеза фермента используют для лечения острых порфирий, биохимическая основа которых заключается в повышенной выработке аминолевулинатсинтетазы. Гематин подавляет синтез этого фермента и быстро снимает острые приступы порфирии.

Возмещение фермента

Успехи современной энзимологии позволяют выделить этот раздел в патогенетическом лечении наследственных болезней. Это вмешательство на уровне первичного белкового продукта гена. Современные методы позволяют получить такое количество активного фермента для экспериментальных и клинических целей, которое необходимо для его восполнения при определенных наследственных болезнях. Выше разбирались случаи возмещающей терапии: гормоны при эндокринопатиях, антигемофильный глобулин при гемофилии, γ-глобулин при агаммаглобулинемии. По такому же принципу точного соответствия недостающего продукта строится стратегия ферментотерапии.

Главный вопрос современных разработок в области ферментотерапии - это методы доставки фермента в клетки-мишени и субклеточные образования, вовлеченные в патологию обмена.

Рабочая гипотеза экзогенного введения фермента основывалась на том, что лизосомы часто являются местом патологического процесса и в то же время играют основную роль в клеточном метаболизме. Возможность доставки ферментов в лизосомы, сохранение их активности в клетке и взаимодействие с субстратом были проверены в опытах с культурами фибробластов, полученных от лиц с различными лизосомными болезнями накопления. Ферменты, введенные в культуральную среду, улучшали обмен соответствующего соединения. Такая коррекция продемонстрирована при различных гликосфинголипидозах, мукополисахаридозах, гликогенозах и гликопротеинозах. Опыты показали, что возможно возмещение фермента, который проникает внутрь клетки, достигает лизосом и нормализует превращение субстрата. Однако внутримышечное, внутривенное и внутритрахеальное введение ферментов, полученных из грибов или органов крупного рогатого скота, ослабленным больным с гликогенозом, мукополисахаридозами, метахроматической лейкодистрофией и болезнью Фабри не дало серьезных положительных результатов. Следовательно, в стратегии ферментотерапии надо было определить основные направления, которые в суммарном виде представлены ниже.

Возможность получения достаточного количества стабильных, неиммуногенных и стерильных ферментов с высокой специфической активностью.

Защита введенной активности от биотрансформации и иммунного надзора, а также доставка фермента в ткань-мишень и субклеточные образования, вовлеченные в патологический процесс.

Модельная проверка на млекопитающих для оценки и выбора наилучшей стратегии ферментотерапии.

Соответствующим образом запланированные и разрешенные биохимические и клинические испытания на больных.

В 70-х годах XX в. была показана возможность получения ферментов из тканей человека и разработаны системы наблюдения за судьбой ферментов в организме млекопитающих. Первые клинические испытания были проведены при различных лизосомных нарушениях. Это были GМ2-ганглиозидоз (β-гексозаминидаза А из мочи), гликогеноз II типа (плацентарная α-галактозидаза), болезнь Фабри (плацентарная α-галактозидаза), болезнь Гоше (плацентарная β-глюкозидаза). Перед клиническим испытанием было установлено, что высокоочищенные ферменты человека гидролизируют естественный субстрат. Проверка показала, что ферменты при внутривенном или подкожном введении обнаруживаются в печеночной ткани. При этом концентрация ферментов в крови уменьшается, а в печени повышается. Однако они не проникают в мозг из-за барьерных функций мозговых оболочек. Отсюда следует вывод о необходимости специфической доставки ферментов в клетки-мишени при каждой болезни. Их доставка в разные клеточные структуры может потребовать специфической очистки или какой-либо химической модификации фермента.

В разработке методов лечения наследственных болезней ферментами в первую очередь надо ориентироваться на патогенетические механизмы болезней: в каких клетках, каким путем и в какой форме откладывается субстрат реакции, с одной стороны, и каким путем фермент в норме достигает субстрата, каковы промежуточные стадии обмена - с другой. Именно вмешательство в патофизиологический механизм, ответственный за синтез, распределение и накопление субстрата, можно использовать с терапевтической целью: в одних случаях надо увеличить время циркуляции фермента в крови, в других - способствовать доставке фермента в строго определенные клетки.

Из анализа первичной клеточной патологии при различных лизосомных болезнях накопления видно, что даже близкие по сути заболевания отличаются друг от друга.

Первичный дефект локализуется в нейронах (сфинголипидозы, гликопротеинозы), в клетках ретикулоэндотелиальной системы (болезнь Нимана-Пика, болезнь Гоше), эндотелии, шванновских клетках, поперечно-полосатой мускулатуре.

Экспериментальные разработки в области ферментотерапии наследственных болезней позволили объективно оценивать захват молекул фермента рецепторами, гепатоцитами, клетками ретикулоэндотелиальной системы, фибробластами, клетками эндотелия сосудов и т.д. Это увеличило возможности направленных разработок лечения наследственных болезней, в первую очередь с использованием новых методов доставки ферментов к клеткам-мишеням в синтетических пузырьках-носителях или микрокапсулах-липосомах либо в естественных элементах - аутологичных эритроцитах. Такие методы доставки разрабатываются для лечения не только наследственных болезней, но и другой патологии. Направленная доставка лекарственных веществ в органы, ткани и клетки - актуальная проблема для медицины в целом.

Современные успехи физико-химической биологии позволяют создавать новые формы микроинкапсулированных ферментных препаратов (опосредованная доставка) или обеспечивать более полный захват циркулирующего в крови фермента рецепторами клетокмишеней (опосредованная рецепция).

Липосома представляет собой многослойный пузырек с чередующимися водными и липидными слоями. При формировании липосом можно изменять заряд стенки, их величину, число слоев. К мембране липосом можно пришить антитела к клеткам-мишеням, что обеспечит более точную доставку липосом. Липосомы, нагруженные ферментами, при различных путях введения хорошо захватываются клетками. Их липидная оболочка разрушается эндогенной липазой, а освободившийся фермент взаимодействует с субстратом.

Наряду с созданием искусственных носителей - липосом - разрабатывают методы нагрузки эритроцитов ферментами. При этом можно использовать гомологичные или даже аутологичные эритроциты. Нагрузка ферментами может осуществляться путем гипотонизации, или диализа, или с помощью хлорпромазининдуцированного эндоцитоза.

Перспективы лечения наследственных болезней возмещением ферментов зависят от успехов энзимологии, клеточной инженерии, физико-химической биологии. Новые подходы должны обеспечить выделение высокоочищенных ферментов из специфических тканей человека, введение их в активной форме в клетку путем опосредованной рецепции или опосредованной доставки, предупреждение биоинактивации, исключение иммунных реакций. Уже имеются подходы к решению каждой из этих задач, поэтому можно надеяться на еще более успешное развитие ферментотерапии наследственных болезней.

ХИРУРГИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ

Хирургическое лечение наследственных болезней занимает существенное место в системе медицинской помощи больным. Это связано с тем, что, во-первых, многие формы наследственной патологии сопровождаются морфогенетическими отклонениями, включая пороки развития. Во-вторых, расширение возможностей хирургической техники сделало доступными многие трудные операции. В-третьих, реанимация и интенсивная терапия сохраняют жизнь новорожденным с наследственными болезнями, а такие пациенты нуждаются в последующей хирургической помощи.

Хирургическая помощь больным с наследственной патологией в общем виде включает удаление, коррекцию, трансплантацию. Операции часто направлены на устранение симптомов болезни. Однако в некоторых случаях хирургическая помощь выходит за рамки симптоматического лечения, приближаясь по эффекту к патогенетическому лечению. Например, для изменения пути патологического превращения субстратов патологических реакций можно использовать хирургическое шунтирование. При гликогенозах I и III типов делают анастомоз между воротной и нижней полой венами. Это позволяет части глюкозы после всасывания в кишечнике обходить печень и не откладываться в ней в виде гликогена. Аналогичный обходной путь предложен при семейной гиперхолестеринемии (тип IIа) - анастомоз между тощей и подвздошной кишками. Это приводит к снижению всасывания холестерина.

Примерами общехирургических видов лечения могут быть операция по поводу наследственного полипоза толстой кишки (ее удаление), спленэктомия при гемоглобинопатиях, удаление глаза при

ретинобластоме, почки при опухоли Вильмса и др. В ряде случаев хирургическое лечение является частью комплексной терапии. Например, при муковисцидозе возможен мекониальный илеус у новорожденных, в процессе развития болезни встречается пневмоторакс. И то и другое устраняется хирургическим путем.

Большое место в лечении наследственных болезней занимает реконструктивная хирургия: при незаращении верхней губы, врожденных пороках сердца, атрезии отделов ЖКТ, гипоспадии, для коррекции костно-мышечной системы и т.д.

Трансплантация органов и тканей как метод лечения наследственных болезней все больше входит в практику. Аллотрансплантация может рассматриваться как передача нормальной генетической информации пациенту с нарушением обмена веществ. Такой подход предполагает пересадку клеток, тканей и органов, содержащих нормальную ДНК, для продукции активных ферментов или других продуктов гена у реципиента. Он особенно эффективен тогда, когда патологический процесс ограничен одним органом или тканью, которые и пересаживают.

Аллотрансплантация уже выполняется при разных наследственных болезнях и позволяет непрерывно восполнять недостаток фермента, гормона, иммунных функций или эффективно предохранять орган от функциональных нарушений, обусловленных мутацией структурного гена. В таблице 10.4 перечислены наследственные болезни, при которых применяется аллотрансплантация.

Таблица 10.4. Применение аллотрансплантации для патогенетического лечения наследственных болезней

Окончание таблицы 10.4

Современная трансплантология обладает большими возможностями, и ее успехи можно использовать в лечении наследственных болезней. Имеются многочисленные сообщения об успешных пересадках органов (костного мозга, вилочковой железы, печени плода, донорской печени, поджелудочной железы, селезенки и особенно почки) при упомянутых в табл. 10.4 состояниях. Трансплантация исправляет патологические механизмы наследственных нарушений.

Помимо пересадки органов разрабатываются методы пересадки клеток, функция которых занимает ключевое место в патогенезе наследственных нарушений обмена. Лечение стволовыми клетками будет рассмотрено ниже.

В заключение следует обратить внимание на огромные возможности хирургического лечения наследственных болезней, используемые еще не в полной мере. В этом плане весьма перспективны микрохирургия и эндоскопическая хирургия.

ЭТИОТРОПНОЕ ЛЕЧЕНИЕ: КЛЕТОЧНАЯ И ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ

Введение

Этиотропное лечение любых болезней оптимально, поскольку оно устраняет первопричину заболевания и в результате полностью его излечивает. Несмотря на успехи симптоматической и патогенетической терапии наследственных болезней, вопрос об их этиотропном лечении не снимается. Чем глубже будут знания в области теорети-

ческой биологии, тем чаще будет подниматься вопрос о радикальном лечении наследственных болезней.

Однако устранение причины наследственной болезни означает такие серьезные манипуляции с генетической информацией у человека, как доставка нормального гена в клетку, выключение мутантного гена, обратная мутация патологического аллеля. Эти задачи достаточно трудны даже при вмешательствах у простейших организмов. К тому же, чтобы провести этиотропное лечение какой-либо наследственной болезни, надо изменить структуру ДНК и не в одной клетке, а во многих функционирующих клетках (и только в функционирующих!). Прежде всего, для этого нужно знать, какое изменение произошло в гене в результате мутации, т.е. наследственная болезнь должна быть описана в химических формулах.

Сложности этиотропного лечения наследственных болезней очевидны, но уже имеются многочисленные возможности для их преодоления, создаваемые успешной расшифровкой генома человека и прогрессом молекулярной медицины.

Несколько принципиальных открытий в генетике и молекулярной биологии создали предпосылки для разработки и клинической проверки методов этиотропного лечения наследственных болезней (генная и клеточная терапия).

В экспериментах с РНК- и ДНК-содержащими вирусами опухолей (начало 1970-х годов) выявлена способность вирусов переносить гены в трансформированные клетки и сформулирована концепция использования вирусов как переносчиков генов, другими словами, концепция создания векторной системы (рекомбинантная ДНК). Успех, достигнутый в экспериментах с рекомбинантной ДНК, уже к середине 1970-х годов обеспечил почти неограниченные возможности в изоляции генов эукариот (в том числе и человека) и манипуляции с ними. В начале 80-х годов была доказана высокая эффективность переноса генов на основе векторных систем в клетки млекопитающих in vitro и in vivo.

Принципиальные вопросы генной терапии у человека решены. Во-первых, гены можно изолировать вместе с фланкирующими (пограничными) областями, содержащими в себе, по меньшей мере, важные регуляторные последовательности. Во-вторых, изолированные гены нетрудно встроить в чужеродные клетки. «Хирургия» трансплантации генов многообразна.

Условия генной терапии разрабатывались удивительно быстро. Первый протокол генной терапии у человека был составлен в 1987 г. и проверен в 1989 г., а с 1990 г. уже началась генная терапия больных.

Этиотропное лечение наследственных болезней может осуществляться на уровне клеток или генов. Организм больного должен получить дополнительную генетическую информацию, способную исправлять наследственный дефект, с геномом аллогенной клетки или в виде специально созданной генно-инженерной конструкции.

Под термином «клеточная терапия» понимают способ лечения путем трансплантации клеток. Пересаженные клетки сохраняют генотип донора, поэтому пересадку можно рассматривать как форму генотерапии, поскольку она приводит к изменению соматического генома. Генная терапия - способ лечения путем введения дополнительной генетической информации в клетки индивида на уровне ДНК или РНК (генно-инженерных конструкций) или путем изменения экспрессии генов.

В целом, к настоящему времени определились четыре направления этиотропного лечения:

Трансплантация аллогенных клеток (клеточная терапия);

Введение генно-инженерных конструкций в ткани больного (генная терапия);

Трансплантация трансгенных клеток с целевой генно-инженерной конструкцией (комбинированная терапия);

Изменение экспрессии генов (генная терапия).

Клеточная терапия

Трансплантация клеток или клеточная терапия - это в настоящее время часть бурно развивающейся регенеративной медицины. Применительно к лечению наследственных болезней речь идет о трансплантации аллогенных клеток, потому что аутологичная пересадка не изменяет мутантного генома клеток. Наиболее эффективных результатов клеточной терапии можно добиться при трансплантации стволовых клеток. Они обладают способностью размножаться в недифференцированном состоянии, а другая их часть дифференцируется в клетки патологически измененного органа, улучшая его функцию. Что такое стволовые клетки, где они находятся, каковы их разновидности и функции см. в книге «Биология стволовых клеток и клеточные технологии в 2 т.» под ред. М.А. Пальцева.

Источники стволовых клеток представлены в табл. 10.5.

Таблица 10.5. Типы стволовых клеток, применяемых для лечения наслед ственных болезней

Первым по времени применения и объему проведенных клеточных трансплантаций является костный мозг и полученные при его культивировании гемопоэтические стволовые клетки, а также мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки. В конце 60-х годов прошлого века впервые для лечения первичных иммунодефицитов применили трансплантацию костного мозга. В последние годы в качестве источника гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромальных клеток используется и пуповинная кровь.

Печень эмбрионов - хороший источник стволовых клеток печеночной и непеченочной (после культивирования) дифференцировки. Клеточная фракция эмбриональной печени после трансплантации в организм реципиента выполняет функции печени, что особенно важно в экстренных случаях поражения печени.

Поперечно-полосатые мышцы в культуре образуют миобласты, миоциты, мезангиобласты, которые обладают способностью к самовоспроизведению и дифференцировке в обратном направлении в поперечно-полосатые мышечные клетки.

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток применяется как эффективная терапия наследственных болезней обмена, главным образом лизосомных болезней накопления и пероксисомных. Всего в мире сделано около 1000 трансплантаций при более чем 20 болезнях. Лечение трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток при

наследственных болезнях обмена основано на выработке недостающих в организме ферментов за счет функционирования донорских клеток. Из всех клинических проколов по более чем 20 болезням только по трем формам получены убедительные результаты, позволяющие рекомендовать трансплантацию таких клеток как метод лечения. Это синдром Гурлер, Х-сцепленная адренолейкодистрофия и болезнь Краббе (глобоидноклеточная лейкодистрофия). Для этих форм отработаны условия кондиционирования, претрансплантационная терапия, строгие показания, возраст детей.

Большой раздел в клеточной терапии занимают болезни крови и кроветворных органов, ассоциированных с недостаточностью продуктов костного мозга. Важнейшим условием является подбор доноров по HLA-антигенам, чтобы снизить реакцию «трансплантат против хозяина». Не останавливаясь на технической стороне клеточной терапии, перечислим болезни, которые уже лечат гемопоэтическими стволовыми клетками. При этом не исключаются другие виды лечения. Трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток используют при лечении следующих болезней: анемии Фанкони, первичных иммунодефицитов, гемоглобинопатий. Переливание моноцитарных фракций костного мозга дает худшие результаты из-за большей антигенности зрелых клеток по сравнению с гемопоэтическими стволовыми.

Более 15 лет назад клеточная терапия была применена для лечения наследственных заболеваний костей - ахондроплазии и несовершенного остеогенеза. Трансплантировали мезенхимальные стромальные клетки, полученные из костного мозга. Лечение было направлено на усиление роста костей. И действительно, применение мезенхимальных стромальных клеток давало эффект ускоренного удлинения костей при дистракционном остеогенезе при ахондроплазии и существенное прибавление в росте у больных с несовершенным остеогенезом.

Для клеточной терапии заболеваний нервной системы имеется много источников стволовых клеток: из нервной системы, жировой ткани, костного мозга и др. Мезенхимальные стромальные клетки костного мозга могут дифференцироваться в нейтральные стволовые клетки. Хотя и проводятся многочисленные экспериментальные разработки, обосновываются новые подходы, проверяются новые клинические протоколы лечения больных стволовыми клетками таких сложных по патогенезу болезней, как болезнь Альцгеймера, хорея Гентингтона, болезнь Паркинсона, миопатия Дюшенна, пока одно-

значных результатов лечения не получено. Все клинические протоколы клеточной терапии нервной системы являются первичными проверками на токсичность и биобезопасность.

Эффективность лечения стволовыми клетками, как правило, невысокая, и терапевтический эффект сохраняется лишь первые 6 мес, поэтому клеточная терапия должна рассматриваться как дополнительный, а не основной метод лечения. Важным методом лечения является сочетание клеточной терапии с лекарственной, особенно ферментативной, для наследственных болезней обмена. Впереди еще много работы по доведению первых результатов до эффективных и безопасных методов лечения. Несмотря на многочисленные клинические исследования клеточной терапии, утвержденных протоколов лечения для конкретных нозологических форм еще нет (тип клеток, количество, способ введения клеток, сроки повторного введения).

Генная терапия

Генная терапия путем введения генно-инженерных конструкций в клетки и ткани больного (трансгеноз in vivo) может стимулировать рост ткани, функцию органа. В этом типе терапии создаются функционально способные генетические конструкции (генетический вектор) в лабораторных условиях. Эти конструкции должны включать целевой ген (или его главную часть), вектор, промотор

(рис. 10.6).

Рис. 10.6. Карта генетической конструкции (плазмиды pAng1) с геном ангиогенина. Обозначения: Ang - кДНК гена ангиогенина; PrCMV - немедленно ранний промотор/энхан- сер цитомегаловируса; PrSV40 - ранний промотор/ориджин вируса SV40; BGH polyA - сигнал полиаденилирования гена гормона роста быка; SV40 polyA - поздний сигнал полиаденилирования вируса SV40; neo r - ген устойчивости к неомицину; amp r - ген устойчивости к ампициллину; ori - ориджин репликации (f1 - фага f1; ColE1 - плазмиды ColE1)

Генная терапия в представленном виде испытывалась главным образом для лечения сердечнососудистых заболеваний: ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей.

Хотя ангиогенез осуществляется целой группой генов (около

12), выбраны два наиболее критичных целевых гена для проверки эффективности генной терапии. При ишемической болезни сердца (в остром и хроническом состояниях) применяли введение гена VEGF (эндотелиального фактора роста сосудов).

Генный препарат на основе плазмидной конструкции, содержащий ген VEGF165 человека, вводится на заключительном этапе операций (аортокоронарного шунтирования, трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации, миниинвазивной реваскуляризации миокарда) в зону, нуждающуюся в неоангиогенезе. У всех больных зарегистрировали клиническое улучшение: отмечен переход в более благоприятный класс стенокардии напряжения, снизилась доза применяемых нитропрепаратов; проба с физической нагрузкой выявляла возрастание порога толерантности; все больные отмечали улучшение качества жизни. При сцинтиграфии отмечалось уменьшение общей площади, а также выраженности дефектов накопления радиофармпрепарата по сравнению с дооперационной картиной.

Проведено лечение нескольких тысяч больных с ишемической болезнью сердца на разных стадиях. Процедура введения генетических конструкций в миокард безопасна. Положительный эффект генотерапии отмечается в большинстве клинических исследований, но он небольшой (8-10%).

Терапевтический ангиогенез в лечении критической ишемии нижних конечностей осуществлялся разными авторами с помощью введения в мышцы голени и бедра нативной ДНК, кодирующей белок VEGF, ген FGF (фактора роста фибробластов), рекомбинантные конструкции на основе разных аденовирусов с геном ангиогенина - ANG.

В нашем исследовании пациентам вводили генно-инженерные конструкции с геном ANG путем прямых внутримышечных инъекций в тибиальную группу мышц пораженной конечности троекратно в равных дозах (3х10 9 бляшкообразующих единиц) с интервалом 3 сут. Каждая процедура включала 4-5 прямых внутримышечных инъекций по 0,3-0,5 мл раствора, равномерно распределенных на площади 15-20х5-6 см. Результаты лечения оценивали через 6-24 мес.

В клинических наблюдениях во всех случаях отмечался положительный эффект: увеличился показатель времени (расстояния) безболевой ходьбы, увеличился показатель плечелодыжечного индекса, уменьшились или даже зажили трофические язвы, увеличилась перфузия мышц нижних конечностей.

Данные литературы и наши наблюдения свидетельствуют о том, что позитивный эффект сохраняется в течение 6-18 мес, после чего возникает потребность в повторных инъекциях препарата. Таким образом, генно-инженерные конструкции, содержащие гены ANG и VEGF, способствуют выработке факторов неоангиогенеза и стимулируют рост кровеносных сосудов в ишемизированных тканях. О состоянии, проблемах и перспективах генной терапии см. в одноименной статье А.В. Киселева с соавт. на компакт-диске.

Лечение трансгенными клетками

Лечение трансгенными клетками с целевой генно-инженерной конструкцией может быть названо комбинированной терапией. Для осуществления этого типа клеточно-генной терапии необходимо осуществить введение целевого гена в клетку. Такая комбинация сочетает свойства клеточного вектора, генной функции и эффект клеточной терапии.

Трансгеноз (перенос генетического материала) in vitro направлен на соматические клетки-мишени, заранее выделенные из организма (например, резецированная печень, культура лимфоцитов, костный мозг, культура фибробластов, опухолевые клетки). Для введения ДНК в клетки млекопитающих уже опробованы многие подходы: химические (микропреципитаты фосфата кальция, DEAE-декстран, диметилсульфоксид); слияние клеток (микроклеток, протопластов); физические (микроинъекции, электропорация, лазерная микроинъекция); вирусные (ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы). Многие невирусные методы малоэффективны (за исключением электропорации и лазерной микроинъекции). Наиболее эффективными переносчиками ДНК в клетки являются «природные шприцы» - вирусы.

Процедура трансгеноза клеток должна заканчиваться проверкой ее успешности. Трансгеноз можно считать успешным, если не менее 5% всех обработанных клеток будут иметь введенный генетический материал.

Конечная процедура генной терапии через трансгеноз соматических клеток in vitro - это реимплантация трансгенных клетокмишеней. Она может быть органотропной (печеночные клетки вводят через воротную вену) или эктопической (клетки костного мозга вводят через периферическую вену).

Клеточно-генная терапия была принята в клинической практике быстрее, чем можно было ожидать. Варианты ее применения можно показать на примере трех болезней.

Недостаточность ADA. Девочка 4 лет (США) страдала редкой наследственной болезнью - первичным иммунодефицитом (тяжелая комбинированная форма), обусловленным мутацией в гене ADA. Все 4 года девочка жила в стерильном боксе. (Пациенты с этим заболеванием не переносят никаких контактов с любой инфекцией из-за тотального отсутствия иммунитета.)

Лимфоциты больной заранее были отделены от остальных элементов крови, Т-лимфоциты стимулированы к росту. Затем in vitro в них был введен ген ADA с помощью ретровирусного вектора. Приготовленные таким образом «генно-инженерные» лимфоциты были возвращены в кровоток.

Указанное событие произошло 14 сентября 1990 г., и эта дата считается днем рождения реальной генной терапии. С этого года стал выходить журнал «Генная терапия».

Из протокола клинического испытания стало ясно, что, во-первых, лимфоциты пациентов с тяжелым иммунодефицитом могут быть изолированы, выращены в лабораторных условиях, в них можно ввести ген, а затем возвратить в крово-

ток больного. Во-вторых, лечение больной было эффективно. Общее количество лимфоцитов возросло до нормального уровня, а количество ADA-белка в Т-клетках увеличилось до 25% нормы. В-третьих, в течение 6 мес перед очередным курсом лечения число «генно-инженерных» лимфоцитов и ADA-фермента в клетках оставалось постоянным. Из стерильного бокса девочку перевезли домой (рис. 10.7).

Рис. 10.7. Первые две девочки, леченные методом генной терапии по поводу тяжелого комбинированного первичного иммунодефицита, обусловленного недостаточностью аденозиндезаминазы (ADA), примерно через 2,5 года после начала лечения

Выбор болезни для начала использования генотерапии был хорошо продуман. Ген ADA к этому времени был клонирован, имел средние размеры, хорошо встраивался в ретровирусные векторы. Ранее при трансплантации костного мозга при

недостаточности ADA было показано, что ключевую роль в болезни играют Т-лимфоциты. Следовательно, на эти клетки-мишени должна быть направлена генотерапия. Важным моментом стало то, что функционирование иммунной системы возможно при уровне ADA-белка 5-10% контрольного. Наконец, АDА -«генно-инженерные» Т-лимфоциты имели селективное преимущество перед исходными дефектными клетками.

Семейная гиперхолестеринемия. Рецепторы ЛПНП, играющих ключевую роль в обмене холестерина, синтезируются в клетках печени. Соответственно на гепатоциты (клетки-мишени) должна быть направлена генотерапия. Одна попытка такого лечения сделана в США у женщины 29 лет с резко выраженным атеросклерозом венечных артерий. Эффект предыдущего хирургического шунтирования уже сошел на нет. Брат больной умер от такой же болезни, не дожив до 30 лет. Генотерапия больной была проведена в несколько этапов.

Больной была сделана частичная (около 15%) гепатэктомия. Удаленную долю печени промыли раствором коллагеназы для разделения гепатоцитов. Получили около 6 млн гепатоцитов. Затем эти клетки выращивали в 800 культуральных чашках на питательной среде. Во время роста в культуре для включения нормального гена ЛПНП в качестве передающего агента использовали ретровирусный вектор. Трансгенные гепатоциты были собраны и введены пациентке через катетер в воротную вену (чтобы клетки достигли печени). Через несколько месяцев при биопсии печени обнаружили, что в некоторых клетках функционирует новый ген. Содержание ЛПНП в крови упало на 15-30%. Улучшение состояния больной позволило проводить лечение только лекарствами, снижающими уровень холестерина.

Рак. Необычайно быстрый прогресс в изучении генома человека и методов генной инженерии позволяет развивать генную терапию не только для моногенно наследуемых болезней, но и для таких многофакторных болезней, как рак. Генная терапия злокачественных новообразований уже начата, хотя на ее пути много трудностей, обусловленных необходимостью обеспечения селективности, специфичности, чувствительности и безопасности переноса генов. В настоящее время применяется следующая стратегия генотерапии рака: повышение иммуногенности опухоли путем вставки цитокиновых генов, генов, кодирующих главный комплекс гистосовместимости, лимфоцитарных лигандов; направленная доставка (векторирование) опухолевых цитокинов в клетки, которые в

пределах опухоли локально могут реализовать токсические эффекты (например, в лимфоциты, инфильтрующие опухоли); использование опухолеспецифических пролекарственных активаторов, т.е. вставка ферментативно пролекарственно-активирующих генов, сливающихся с промоторными системами, которые реализуются через дифференциально контролируемую (идеально опухолеспецифическую) транскрипцию; введение маркирующих генов, которые могут обеспечивать выявление минимально оставленных после операции или разрастающихся опухолей; искусственная репрессия функций генов путем вставки генов.

Небольшое число попыток генотерапии злокачественных опухолей связано с введением в клетки резецированной опухоли генов ИЛ-2 или ФНО. Затем эти клетки вводят подкожно в область бедра. Через 3 нед удаляют регионарный лимфатический узел (для места введения смеси трансгенных опухолевых клеток). Культивируют Т-лимфоциты, выделенные из этого узла. Кроме того, размножают лимфоциты из опухоли (инфильтрирующие опухоль). Пациенту вводят общую массу лимфоцитов, что обеспечивает иммунную реакцию на опухолевые клетки. Так лечили больных злокачественной меланомой, раком почки, запущенным раком разных органов.

Изменение экспрессии генов как метод лечения

Это направление генной терапии открылось для научных разработок в связи с прогрессом функциональной геномики как части генома человека, другими словами, с увеличением знаний об основах нормальной и патологической экспрессии генов. Изменения экспрессии генов можно достичь путем фармакологической модуляции или РНКинтерференции. На сегодня можно говорить о трех направлениях разработки методов лечения наследственных болезней путем изменения экспрессии генов: повышение экспрессии в гене, определяющим болезнь; повышение экспрессии в гене, не относящимся к болезни; уменьшение экспрессии продукта аномального доминантного гена. - При наследственном ангионевротическом отеке (аутосомнодоминантная болезнь) у больных непредвиденно развивается подслизистый и подкожный невротический отек. Обусловлено это недостаточной выработкой ингибитора эстеразы компонента комплемента С1. Из-за быстрой природы атак отека профилактически назначают лечение синтетическими андрогенами (даназолом). Андрогены значительно увеличивают количество

мРНК ингибитора С1 (возможно в нормальном и мутантном локусах). Частота серьезных приступов у больных резко уменьшается.

Терапия путем фармакологической модуляции экспрессии гена может быть направлена на увеличение экспрессии нормального гена с целью компенсации эффекта мутации в другом гене. Гипометилирование ДНК увеличивает количество фетального гемоглобина у взрослых. Увеличение уровня фетального гемоглобина (α2γ2) вполне адекватно для пациента с серповидноклеточной анемией, поскольку гемоглобин F (фетальный) является нормальным переносчиком кислорода и препятствует полимеризации гемоглобина S. Суть модуляции в следующем - метилирование промотора тормозится приемом аналога цитидина децитабином (5-аза-2"-деоксицитидин), который включается вместо цитидина. Блокада метилирования приводит к увеличению экспрессии гена γ-глобина и доли гемоглобина F в крови. Такая комбинация, очевидно, окажется полезной и для лечения β-талассемии.

Уменьшения экспрессии доминантного гена можно достичь путем РНК-интерференции (информацию о малой интерферирующей РНК см. в гл. 1). При многих наследственных болезнях патологические изменения вызваны токсическими продуктами (белки при болезнях экспансии нестабильных повторов) или снижением вклада нормального белка (аномальный коллаген при несовершенном остеогенезе). Патогенетически ясно, что надо уменьшить объем синтеза мутантного белка без нарушения синтеза белка с нормального аллеля. Эта цель может быть достигнута РНК-интерференцией. Цепи коротких РНК связываются с целевой РНК и вызывают их распад. Ориентируясь на быстрый прогресс в изучении малых РНК (малых интерферирующих РНК), можно надеяться на большой потенциал этой технологии для лечения наследственных болезней, хотя РНКинтерференционная терапия находится еще на раннем этапе развития.

Риски клеточной и генной терапии

Как видно из приведенных выше примеров, эра генотерапии человека уже началась. Определены принципы и методические подходы генотерапии, отобраны болезни, потенциально подлежащие этому

лечению. Работа продолжается одновременно в разных странах и в различных направлениях. Уже очевидно, что генотерапия будет применяться для лечения не только наследственных и сердечнососудистых болезней, но и злокачественных опухолей и хронических вирусных инфекций.

Вместе с тем необходимо отметить, что применять эти методы надо крайне осторожно (это относится именно к применению, а не к разработке!). Это особенно важно при лечении наследственных болезней (особенно расширенном), даже если будут еще более решительные прорывы в способах доставки генов в клетки-мишени. Необходимо внимательно наблюдать за отдельными результатами лечения и строго соблюдать этические и деонтологические принципы.

Три типа рисков клеточной и генной терапии уже обозначились.

Неблагоприятный ответ на вектор или комбинацию вектор/ болезнь. По крайней мере, один пациент погиб из-за патологического иммунного ответа на введенный ген с аденовирусным вектором. Вывод из этого случая уже сделан - при выборе вектора необходимо учитывать патофизиологические характеристики наследственного заболевания.

Инсерционный мутагенез, приводящий к злокачественным новообразованиям. Существует вероятность, что переданные клетка или ген (неважно - в чистом виде или с трансгенной клеткой) может активизировать протоонкогены или нарушить супрессоры опухолевого роста. Непредвиденный ранее механизм онкогенеза был обнаружен у некоторых пациентов после генотерапии Х-сцепленного комбинированного иммунодефицита. Перенос гена у этих больных содействовал развитию лимфопролиферативного заболевания.

Онкологический риск при клеточной терапии в связи с генетической нестабильностью клеточных трансплантатов, в культуре которых нередко возникают аномальные хромосомные клоны.

Все типы рисков могут быть сведены к минимуму при правильной проверке методов на безопасность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, лечение наследственных болезней - необычайно трудная задача, не всегда эффективно решаемая. Несмотря на это, оно должно быть постоянным и настойчивым. Нестойкость, а часто и недо-

статочная выраженность эффектов терапии не означают отказа от ее постоянного проведения не только с клинической точки зрения, но и по деонтологическим соображениям. При этом следует принимать во внимание две особенности лечения наследственных болезней:

Необходимость долговременного контроля лечения;

Исходная диагностическая точность до назначения лечения в связи с генетической гетерогенностью наследственных болезней.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА И ПОНЯТИЯ

Виды симптоматического лечения Генная терапия (общая схема)

Генная терапия злокачественных новообразований Генная терапия моногенных болезней (примеры) Евфеника

Концепция вырождающихся семей Коррекция обмена на уровне продукта Коррекция обмена на уровне субстрата Клеточная терапия Стволовые клетки Негативная евгеника

Примеры лекарственного симптоматического лечения

Принципы патогенетического лечения

Трансгеноз

Ферментотерапия наследственных болезней Хирургические методы лечения

Биология стволовых клеток и клеточные технологии: в 2 т. / под ред. М.А. Пальцева. - М.: Медицина, 2009. - 728 с.

Долгих М.С. Возможности генной терапии, ее методы, объекты и перспективы // Успехи современной биологии. - Т. 124. - № 2. -

С. 123-143.

Марахонов А.В., Баранова А.В., Скоблов М.Ю. РНК-интерференция: фундаментальные и прикладные аспекты // Медицинская генетика. - 2008. - № 10. - С. 44-55.

Наследственные заболевания относятся к категории болезней, проявляющихся возникновением стойких изменений в процессах передачи генетической информации человеческими половыми клетками.

Общие понятия о наследственных заболеваниях

Главной причиной появления указанных патологий являются мутации генов. Несмотря на то, что незначительные отклонения в хромосомном аппарате происходят довольно часто, они тут же устраняются или же приводят к улучшению тех или иных особенностей организма уже для последующих поколений людей. Но, к сожалению, некоторые изменения являются довольно существенными, например, уменьшение или увеличение количество хромосом в клетках, вследствие чего возникают серьезные аномалии.

Большинство мутаций происходят под воздействием негативных факторов окружающей среды, таких как ионизирующая радиация, токсичные вещества, некоторые лекарственные препараты. Тем не менее, в ряде случаев установить причину возникших изменений не представляется возможным, поэтому предполагается, что они появляются случайным образом, например, в процессе оплодотворения яйцеклетки или первоначального деления зародышевых клеток.

Методы лечения наследственных заболеваний

Несмотря на все достижения современной медицины, лечение наследственных заболеваний предполагает применение преимущественно симптоматической терапии и не приводит к полному выздоровлению больного, а направлено лишь на снижение степени проявления симптомов.

Наиболее часто используют следующие методы:

• диетотерапия – важный этап процесса избавления от негативных последствий целого ряда болезней. Например, при фенилкетонурии из рациона полностью исключают продукты, содержащие фенилаланин, в том числе молоко, рыбу и мясо. При погрешностях в питании самочувствие больного значительно ухудшается, кроме того, наблюдается снижение степени интеллекта вплоть до развития тяжелой идиотии. Поэтому врачи настаивают на соблюдении диеты и выносят предупреждение о том, что ее несоблюдение чревато развитием опасных последствий;
• дополнительное поступление коферментов, в частности, витаминов;
• обеспечение своевременного выведения из организма токсинов, накапливающихся вследствие нарушений обмена веществ. Так, при болезни Вильсона-Коновалова для нейтрализации меди пациент должен принимать д-пеницилламин, а для недопущения избыточного накопления железа при геноглобинопатиях обычно назначают десферал;
• прием веществ, выработка которых в организме блокирована вследствие заболевания (например, цитидиловой кислоты в случае оротоацидурии);
• назначение недостающих гормонов при гипофизарном нанизме и других подобных состояниях;
• блокировка чрезмерной активности ферментов при помощи игнибиторов;
• трансплантация тканей, органов или клеток с нормальной генетической информацией.

Кроме того, о том, каковы возможности современной медицинской науки в лечении хромосомныханомалий, можно узнать, ознакомившись с достижениями генотерапии. Это направление основано на выполнении переноса генетического материала в человеческий организм при условии доставки гена в так называемые клетки-мишени с помощью различных методов.

Показания к назначению

Лечение наследственных болезней осуществляется только в случае точного установления заболевания. При этом перед назначением терапевтических мероприятий проводят целый ряд анализов, чтобы установить, какие гормоны и прочие вещества производятся в организме в избытке, а какие – в недостаточном количестве, чтобы подобрать наиболее эффективную дозировку препаратов.

В процессе приема медикаментов постоянно осуществляют контроль за состоянием пациента и при необходимости вносят изменения в ход лечения.

Как правило, лекарственные средства таким пациентам следует принимать пожизненно или в течение длительного промежутка времени (например, до периода окончания процесса роста тела), а диетические рекомендации следует выполнять неукоснительно и постоянно.

Противопоказания

При разработке курса терапии учитывают возможные индивидуальные противопоказания к применению и при необходимости заменяют одни препараты другими.

В случае принятия решения о пересадке органов или тканей при некоторых наследственных недугах обязательно принимают во внимание риск возникновения отрицательных последствий после оперативного вмешательства.

Наследственные заболевания – это болезни, появление и развитие которых связано со сложными нарушениями в наследственном аппарате клеток, передаваемых через гаметы (репродуктивные клетки). Обусловлено возникновение таких недугов нарушениями в процессах хранения, реализации и передачи генетической информации.

Причины появления наследственных заболеваний

В основе болезней данной группы лежат мутации генной информации. Они могут быть выявлены у ребенка сразу после рождения, а могут проявиться у уже взрослого человека спустя долгое время.

Появление наследственных заболеваний может быть связано только с тремя причинами:

1. Нарушение хромосом. Это добавление лишней хромосомы или утеря одной из 46.
2. Изменения структуры хромосом. Вызывают болезни изменения, происходящие в половых клетках родителей.
3. Генные мутации. Заболевания возникают из-за мутации как отдельных генов, так и из-за нарушения комплекса генов.

Генные мутации относят к наследственно предрасположенным, но их проявление зависит от влияния внешней среды. Именно поэтому к причинам такого наследственного заболевания, как сахарный диабет или гипертоническая болезнь, помимо мутаций, относятся также неправильное питание, длительное перенапряжение нервной системы, и психические травмы.

Виды наследственных заболеваний

Классификация таких болезней тесно связана с причинами их появления. Видами наследственных заболеваний являются:

• генетические болезни – возникают в результате повреждения ДНК на уровне гена;
• хромосомные болезни – связаны со сложной аномалией количества хромосом или же с их аберрациями;
• болезни с наследственной предрасположенностью.

Для качественного лечения знать, какие бывают наследственные заболевания человека, недостаточно, нужно обязательно вовремя выявить их или вероятность их появления. Для этого ученые используют несколько методов:

1. Генеалогический. С помощью изучении родословной человека можно выявить особенности наследования как нормальных, так и патологических признаков организма.
2. Близнецовый. Такая диагностика наследственных заболеваний представляет собой изучение сходства и различий близнецов для выявления влияния внешней среды и наследственности на развитие различных генетических болезней.
3. Цитогенетический. Исследование структуры хромосом у больных и здоровых людей.
4. Биохимический метод. Наблюдение за особенностями .

Кроме этого, практически все женщины во время беременности проходят ультразвуковое исследование. Оно позволяет по признакам плода выявлять врожденные пороки развития, начиная с I-го триместра, а также заподозрить наличие у ребенка некоторых наследственных заболеваний нервной системы или хромосомных болезней.

Профилактика наследственных заболеваний

Еще совсем недавно даже ученые не знали, каковы возможности лечения наследственных заболеваний. Но изучение патогенеза позволило найти путь излечения некоторых видов болезней. К примеру, пороки сердца сегодня можно успешно вылечить хирургическим путем.

Множество генетических недугов, к сожалению, так до конца и не изучены. Поэтому в современной медицине огромное значение отводится профилактике наследственных заболеваний.

К методам предотвращения появления таких болезней относят планирование деторождения и отказ от вынашивания ребенка в случаях высокого риска врожденной патологии, прерывание беременности при высокой вероятности заболевания плода, а также коррекция проявления патологических генотипов.